本发明公开了一种淡紫醌霉素及其甲酯的制备方法。以链黑菌素产生菌-柔毛链霉菌Streptomyces.flocculus CGMCC4.1223作为出发菌株,对该链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶基因stnBl实行选择性敲除,获得相应的stnBl基因失活突变株ΔstnBl;对突变株发酵产物粗提物采用反相硅胶、凝胶等柱层析和半制备HPLC等色谱分析技术,制得淡紫醌霉素及其甲酯。本发明建立了利用链黑菌素产生菌通过基因工程手段制备淡紫醌霉素的方法,提高了淡紫醌霉素和淡紫醌霉素甲酯的产量,分别达到每5升培养基可以获得约1mg淡紫醌霉素和20mg淡紫醌霉素甲酯,并且经过菌种优化和发酵优化还有进一步提升的空间。
1.一种淡紫醌霉素的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomycesxa0flocculusxa0CGMCCxa04.1223为出发菌株,克隆得到链黑菌素生物合成基因簇;B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnB1基因进行选择性失活,获得stnB1基因失活突变菌株ΔstnB1;所述选择性失活包括如下步骤:设计一对stnB1基因的敲除引物如下:sftarstnB1-For:5′-GTGGACCGCGATATTTACACCAGCGAGAAGATCTTCGCGCTGGAGattccggggatccgtcgacc-3′sftarstnB1-Rev:5′-GTCCCGCACGTCGGCTCCCTCGCCGCCCCGGCCGGGCGCGACCCCtgtaggctggagctgcttc-3′;C、对所述突变菌株ΔstnB1进行发酵,将发酵液离心,离心后的滤液调整pH值至9~10,用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取,取水相滤液;D、调整所述水相滤液pH值至4~5,用所述不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取,收集中等极性有机溶剂相B,浓缩得到粗提物B,对所述粗提物B进行纯化,即得;所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。
2.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法,其特征在于,步骤C中,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3~2:1。
3.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法,其特征在于,步骤D中,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与水相滤液的体积比为1:3~2:1。
4.如权利要求1所述的淡紫醌霉素的制备方法,其特征在于,步骤D中,所述纯化为:用pH值为11~13的碱性水溶液溶解所述粗提物B并离心,收集上清液;向上清液中滴加盐酸至出现沉淀;离心弃去上清,沉淀冻干后加入乙腈溶解,经半制备性PHLC,以乙腈水溶液洗脱,接收对应的吸收峰,合并馏分后放置-20°C以下,待有沉淀析出后低温离心,弃去上清,冻干沉淀,即得所述淡紫醌霉素。
5.如权利要求4所述的淡紫醌霉素的制备方法,其特征在于,所述乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为20%~100%。
6.如权利要求4所述的淡紫醌霉素的制备方法,其特征在于,所述碱性水溶液为
0.1~1Mxa0NaOH溶液。
7.一种淡紫醌霉素甲酯的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomycesxa0flocculusxa0CGMCCxa04.1223为出发菌株,克隆得到链黑菌素生物合成基因簇;B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnB1基因进行选择性失活,获得stnB1基因失活突变菌株ΔstnB1;所述选择性失活包括如下步骤:设计一对stnB1基因的敲除引物如下:sftarstnB1-For:5′-GTGGACCGCGATATTTACACCAGCGAGAAGATCTTCGCGCTGGAGattccggggatccgtcgacc-3′sftarstnB1-Rev:5′-GTCCCGCACGTCGGCTCCCTCGCCGCCCCGGCCGGGCGCGACCCCtgtaggctggagctgcttc-3′;C、对所述突变菌株ΔstnB1进行发酵,将发酵液离心,离心后的滤液调整pH值至9~10,用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取,保留中等极性有机溶剂相A,浓缩得到粗提物A,对所述粗提物A进行纯化,即得;步骤C中,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。
8.如权利要求7所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法,其特征在于,步骤C中,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3~2:1。
9.如权利要求7所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法,其特征在于,步骤C中,所述纯化为:将粗提物A用正相硅胶柱层析,以石油醚和中等极性有机溶剂B的混合物作为流动相洗脱,经HPLC分析检测,合并含有淡紫醌霉素甲酯的馏分并浓缩,然后用反相硅胶进行柱层析,用甲醇水溶液洗脱,将所得到的馏分经HPLC检测后合并馏分,浓缩干燥,得淡紫醌霉素甲酯;所述中等极性有机溶剂B为乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮或异丙醇。
10.如权利要求9所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法,其特征在于,所述石油醚和中等极性有机溶剂B的体积比为1:3~10:1。
11.如权利要求9所述的淡紫醌霉素甲酯的制备方法,其特征在于,所述甲醇水溶液中甲醇的体积浓度为60%~100%。技术领域
本发明涉及抗肿瘤试剂制备领域,尤其涉及一种抗肿瘤试剂淡紫醌霉素lavendamycin及其甲酯的生产工程菌株构建方法及它们的制备方法。
背景技术
链黑菌素是一个由绒毛链霉菌(Streptomycesxa0flocculus)产生的具有独特喹啉环结构的抗肿瘤抗生素。其抗肿瘤活性良好,是一种广谱抗肿瘤抗生素,对脑癌、颈癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌,特别是对白血病、淋巴瘤和黑素瘤具有很好的疗效。链黑菌素的药理作用是:可选择性地抑DNA合成,主要作用于S期,一个分子的链黑菌素可与2000个分子的脱氧核苷酸稳定地结合,并能使瘤细胞染色体断裂,使已形成的DNA降解.由于具有较大的骨髓毒性,因此很少单独用药用于临床。链黑菌素含有四个环,其中三个环几乎处于同一个平面,而第四个环与这个平面几乎呈垂直状态。淡紫醌霉素(lavendamycin)是从链霉菌(S.lavenduleaxa0strainxa0C22030)分离鉴定的氨基醌类化合物,具有与链黑菌素相类似的结构,但是其化学结构含有五个环,这五个环几乎处于同一平面。淡紫醌霉素具有与链黑菌素相近的抗肿瘤活性和抗肿瘤谱,但是比链黑菌素低得多的毒性。自1981年淡紫醌霉素被报道以来,仅仅只有一例关于其产生菌的报道,目前该产生菌被国外公司保存,且产量低,文献报道在8升发酵培养基中仅获得0.3mg淡紫醌霉素。而淡紫醌霉素甲酯则是淡紫醌霉素利用化学合成手段通过与甲醇发生酯化反应获得的抗生素,目前并没有天然微生物产生淡紫醌霉素甲酯的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供利用链黑菌素产生菌通过生物技术操作制备淡紫醌霉素lavendamycin及其甲酯的方法。链黑菌素产生菌Streptomycesxa0flocculusCGMCC4.1223的菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心,寄存来源是上海医药工业研究院。参考文献:中国科学院微生物研究所放线菌分类组,《链霉菌鉴定手册》,1975,P202-205,科学出版社,北京。本发明通过对柔毛链霉菌Streptomycesxa0flocculusxa0CGMCC4.1223进行针对链黑菌素生物合成基因簇中双氧化酶的选择性失活突变,得到相应的双氧化酶失活突变菌株,从该突变株的发酵液中分离到淡紫醌霉素(lavendamycin)及其甲酯化合物。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:第一方面,本发明涉及一种淡紫醌霉素的制备方法,包括如下步骤:A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomycesxa0flocculusxa0CGMCC4.1223为出发菌株,克隆得到链黑菌素生物合成基因簇;B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnBl基因进行选择性失活,获得stnBl基因失活突变菌株ΔstnBl;C、对所述突变菌株ΔstnBl进行发酵,将发酵液离心,离心后的滤液调整pH值至9~10,用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取,取水相滤液;D、调整所述水相滤液pH值至4~5,用所述不溶于水的中等极性有机溶剂反复萃取,收集中等极性有机溶剂相B,浓缩得到粗提物B,对所述粗提物B进行纯化,即得。该淡紫醌霉素,其结构式如式(I)所示:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>优选地,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。优选地,步骤C中,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3~2:1。优选地,步骤D中,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与水相滤液的体积比为1:3~2:1。优选地,步骤D中,所述纯化为:用pH值为11~13的碱性水溶液溶解所述粗提物B并离心,收集上清液;向上清液中滴加盐酸至出现沉淀;离心弃去上清,沉淀冻干后加入乙腈溶解,经半制备性PHLC(ZORBAXxa0XDB-C18,9.2*250mm,5A粒径)色谱,以乙腈水溶液洗脱,接收对应的吸收峰,合并馏分后放置-20°C以下,待有沉淀析出后低温离心,弃去上清,冻干沉淀,即得所述淡紫醌霉素。优选地,所述乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为20%~100%。优选地,所述碱性水溶液为0.1~1Mxa0NaOH溶液。第二方面,本发明还涉及一种淡紫醌霉素甲酯的制备方法,包括如下步骤:A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomycesxa0flocculusxa0CGMCC4.1223为出发菌株,克隆得到链黑菌素生物合成基因簇;B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnBl基因进行选择性失活,获得stnBl基因失活突变菌株ΔstnBl;C、对所述突变菌株ΔstnBl进行发酵,将发酵液离心,离心后的滤液调整pH值至9~10,用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取,保留中等极性有机溶剂相A,浓缩得到粗提物A,对所述粗提物A进行纯化,即得。该淡紫醌霉素甲酯,其结构式如式(II)所示:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>优选地,步骤C中,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。优选地,步骤C中,所述不溶于水的中等极性有机溶剂A与离心后的滤液的体积比为1:3~2:1。优选地,步骤C中,所述纯化为:将粗提物A用正相硅胶柱层析,以石油醚和中等极性有机溶剂B的混合物作为流动相洗脱,经HPLC分析检测,合并含有淡紫醌霉素甲酯的馏分并浓缩,然后用反相硅胶(YMC*GELxa0ODS-A,120A孔径,50um粒径)进行柱层析,用甲醇水溶液洗脱,将所得到的馏分经HPLC检测后合并馏分,浓缩干燥,得淡紫醌霉素甲酯。优选地,所述作为流动相的石油醚和中等极性有机溶剂B的体积比为1:3~10:1。优选地,所述中等极性有机溶剂B为乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮或异丙醇。优选地,所述甲醇水溶液中甲醇的体积浓度为60%~100%。本发明具有的有益效果如下:绒毛链霉菌(Streptomycesxa0flocculusxa0CGMCC4.1223)被证实可以产生链黑菌素;目前有多株已报道的链黑菌素产生菌,同时在许多菌种保藏中心都能任意买到链黑菌素产生菌;本发明利用分子生物学原理和技术,从链黑菌素产生菌中获得链黑菌素生物合成基因簇,并在基因水平对链黑菌素的生物合成基因进行选择性失活获得相应的突变菌株,从链黑菌素产生菌突变株中制备淡紫醌霉素(化合物1)及其甲酯(2),解除了国外对国内的菌种封锁。此外,经过试验验证,我们在产生菌Streptomycesxa0flocculusxa0CGMCC4.1223中利用摸索建立的方法提高了淡紫醌霉素和淡紫醌霉素甲酯的产量,分别达到了每5升培养基可以获得约1mg淡紫醌霉素和20mg的淡紫醌霉素甲酯,并且未来经过菌种优化和发酵优化还有进一步提升的空间。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:图1为淡紫醌霉素lavendamycin及其甲酯的化学结构示意图;图2为stnBl敲除突变株ΔstnBl的构建策略示意图;图3为敲除突变株ΔstnBl的基因型验证图,其中泳道1为ΔstnBl突变株的PCR产物,泳道2为对照的链黑菌素原始产生菌的PCR产物,泳道M为1kbxa0DNAxa0marker;图4为突变株ΔstnBl和野生型链黑菌素产生菌的发酵提取物的HPLC检测图谱以及淡紫醌霉素及其甲酯的保留时间示意图;其中,I为ΔstnBl发酵提取物的HPLC检测图谱,II为野生型链黑菌素产生菌发酵提取物的HPLC检测图谱,1为淡紫醌霉素,2为淡紫醌霉素甲酯,SN为链黑菌素。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1、氧化酶StnB1编码基因敲除突变株ΔstnBl的获得利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株;stnBl敲除突变株ΔstnBl的构建策略示意图如图2所示。根据获得的链黑菌素合成基因簇序列,参照文献报道的PCR-targeting系统,设计一对stnBl基因的敲除引物如下:sftarstnA-For:5′-GTGGACCGCGATATTTACACCAGCGAGAAGATCTTCGCGCTGGAGattccggggatccgtcgacc-3′sftarstnA-Rev:5′-GTCCCGCACGTCGGCTCCCTCGCCGCCCCGGCCGGGCGCGACCCCtgtaggctggagctgcttc-3′其中引物的5′-端45bp大写字母部分序列与stnBl基因相匹配,而3′-端的小写字母部分序列分别与质粒pIJ773中一个包含转移起始序列和阿泊拉抗性基因的片段两侧的DNA序列一致或互补。参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒,然后将获得的质粒转入到结合转移的供体菌(大肠杆菌)中。具体步骤如下:(1)将cosmid质粒pJTU4002转入大肠杆菌E.coliBW25113/pIJ790中得到E.coliBW25113/pIJ790/pJTU4002,用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达,并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoRxa0I和Hindxa0III酶切质粒pIJ773,回收约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段,以此作为PCR模板,用sftarstnB1-For和sftarstnB1-Rev引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物。PCR反应体系(50μl):TaqDNA聚合酶1U,10×Buffer5μl,dNTPs0.5mmol/L,DMSO2.5μl,引物各0.5μmol/L,DNA模板约1ng,加水至50μl。PCR反应条件为:预变性94°C5min;扩增循环为94°C变性45s,55°C退火30s,72°C延伸90s,35个循环;最后72°C延伸5min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组,涂布于LB筛选平板(含100μg/ml氨苄青霉素,50μg/ml阿泊拉霉素),于37°C过夜培养,从平板上挑出阳性单克隆,抽提质粒pJTU4025,该质粒中的stnBl基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pJTU4025电转到E.coliET12567/pUZ8002中,获得含有pUZ8002/pJTU4025的大肠杆菌E.colixa0ET12567/pUZ8002/pJTU4025,作为接合转移的供体菌。野生型柔毛链霉菌Streptomycesxa0flocculusxa0CGMCC4.1223菌株在SFM固体培养基中培养7天,用棉签蘸取无菌水收集平板上产生的白色孢子,8000r/min离心10min收集孢子,用0.05Mxa0TES溶液(pH8.5)清洗2遍后,用500μl0.05Mxa0TES溶液(pH8.5)重悬孢子,在50°C热激10min,之后加入等体积500μl孢子预萌发培养基于37°CC培养2-4小时,之后离心弃去上清,用500μlxa0LB重悬,作为接合转移的受体菌。供体菌E.colixa0ET12567/pUZ8002/pJTU4025在50ml含25μg/ml卡那霉素,25μg/ml氯霉素,100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37°C生长至OD₆₀₀值约为0.6时,离心收集菌体(4000r/min,10min),用LB清洗菌体2遍,悬浮于500μlLB培养基中,作为接合转移的供体菌。将上述受体菌和供体菌各取100μl混合均匀涂布于不含任何抗生素的IWL-4固体培养基上,吹干后,于30°CC培养16h。然后将平板取出后用1ml含有硫链丝菌素和阿泊拉抗生素的水覆盖平板,其终浓度为35μg/ml阿泊拉霉素和25μg/ml硫链丝菌素,吹干后,置于30°C培养箱中,培养4天后观察。当接合转移平板上长出单克隆小菌落后,挑取单克隆菌体在含有35μg/ml阿泊拉霉素的SFM固体培养基平板上扩大培养,以确证其不是假阳性克隆。然后挑取在含有35μg/ml阿泊拉霉素35μg/ml平板上正常生长的克隆接种到25ml含有35μg/ml阿泊拉霉素的TSBY培养基中,30°CC培养2天后进行松弛培养,即转接50μl至无抗TSBY培养基中培养2天,重复2次后将培养物按照菌体:培养基体积比10^-3-10^-5,总体积500μl稀释涂布含35μg/ml阿泊拉霉素SFM固体培养基平板培养4天。将长出的单菌落一分为二,分别接种至含35μg/ml阿泊拉霉素平板和25μg/ml硫链丝菌素平板并做好标记培养4天。然后观察平板,挑取在含35μg/ml阿泊拉霉素抗性平板上生长但是在含25μg/ml硫链丝菌素抗性平板上不长的克隆接种到25ml含35μg/ml阿泊拉霉素TSBY培养基中,培养2天后抽取各个突变株的基因组DNA,利用检测引物进行PCR反应以检测其突变株基因型的正确性。检测引物如下:sftarstnB1-T-For:5′-GAACGACAAACTGCTGCTCC-3′sftarstnB1-T-Rev:5′-AAGTAGAAATCGCGCAGCGC-3′能够通过上述PCR引物扩增且仅能扩增出1434bp大小片段的克隆为阳性克隆(见图3),即获得stnBl基因被阿泊拉霉素抗性基因取代的突变菌株ΔstnBl。实施例2、突变株ΔstnB1的发酵和发酵产物的萃取1、培养基:(1)种子培养基:每升种子培养基中含有酵母抽提物5g,TRYPTONExa0SOYAxa0BROTH30g,阿泊拉霉素35mg,余量为水,pH7.0。(2)发酵培养基:每升发酵培养基中含有葡萄糖25g,黄豆饼粉15g,Na₂HPO₄·12H₂O3g,K₂HPO₄3g,MgSO₄·7H₂O0.25g,NaCl5g,KCl0.5g,余量为水,pH7.0。(3)SFM培养基:每升需加黄豆饼粉20g,甘露醇20g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,pH7.5。(4)孢子预萌发培养基:每100ml中含有酵母膏1g,酪蛋白氨基酸1g,CaCl₂0.01M(需配制5M的原液,分开灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中)(5)IWL-4培养基:每升含可溶性淀粉10g,KH₂PO₄1g,MgSO₄1g,NaCl1g,(NH₄)₂SO₄2g,CaCO₃2g,FeSO₄1mg,MnCl₂1mg,ZnSO₄1mg,酵母提取物0.5mg,酪蛋白水解物1mg,Agar20g用蒸馏水定容至1升。2、发酵:将突变株ΔstnBl接种到100ml种子培养基中,25ml×4瓶,30°C,220rpm,培养3d,然后按1%的接种量接种到8L发酵培养基中,200ml×40瓶,30°C,220rpm,培养7d,得到发酵产物。3、发酵产物的萃取:将各突变株ΔstnBl的发酵液离心,将离心后的滤液调整pH值至9.5(pH值可为9~10,本实施例优选9.5),之后用等体积的乙酸乙酯(不溶于水的中等极性有机溶剂A均可选用,如:乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇;其与离心后的滤液的体积比为1:3~2:1;本实施例中选用与离心后的滤液等体积的乙酸乙酯。)反复萃取三次,保留乙酸乙酯相A,浓缩得到粗提物A。调整剩余水相滤液pH值至5.5(pH值可为4~5,本实施例优选4.5),再次用等体积乙酸乙酯(其与水相滤液的体积比为1:3~2:1,本实施例中选用等体积)反复萃取三次,收集乙酸乙酯相B,浓缩得粗提物B。各代谢产物粗提物经HPLC检测,HPLC检测条件为:SBxa0C18反相柱4.6*150mm。流动相为A(H₂O)/B(CH₃CN)。流速为0.6ml/min。洗脱程序:10%B至70%B(线性梯度,0-40min.),70%B至100B%(线性梯度,41-45min),100%B(45-50min);图4为突变株ΔstnBl与野生型菌株发酵图谱的比较。由图3可知,泳道1为突变株基因型验证图谱,与泳道2中基因型验证图谱相比较,证明stnBl基因已经被敲除。实施例3、化合物1和2的分离提纯1、将粗提物B用pH11.0(pH值可为11~13,本实施例优选11.0)的碱性水溶液(可为0.1~1Mxa0NaOH溶液)溶解并离心,收集深红色上清液。向上清液中逐步边滴加浓盐酸边摇匀,至出现深红色沉淀。离心弃去上清,沉淀冻干后加入乙腈溶解,再经半制备HPLC(ZORBAXxa0XDB-C18,9.2*250mm,5μm粒径),以乙腈:水体积比20%~100%洗脱,流速为2ml/min,接收对应的吸收峰,合并馏分后放置-80°C低温(-20°C以下均可,本实施例优选-80°C),待有红色沉淀析出后低温离心,弃去上清,冻干沉淀得到化合物1,淡紫醌霉素,其结构示意图如图1所示。化合物1(淡紫醌霉素):暗红色晶体,由高分辨质谱HR-ESI-MS(m/z399.1095,[M+H]⁺)得到其分子式为C₂₂H₁₅N₄O₄。¹Hxa0NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ_H12.07(s,H,5′,8′-NH),9.04(d,J=8.5Hz,1H,H-3),8.49(d,J=8.0Hz,1H,H-12′),8.43(d,J=8.0Hz,1H,H-4),7.79(d,J=8.5Hz,1H,H-9′),7.71(t,J=7.5Hz,1H,H-10′),7.43(t,J=7.5Hz,1H,H-11′),5.96(s,1H,H-6),3.16(s,3H,3′-CH3)。2、将乙酸乙酯相A浓缩,用正相硅胶柱层析,以石油醚:乙酸乙酯(可为包括乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮、异丙醇等的中等极性有机溶剂B中的一种,本实施例中选用乙酸乙酯)1:3~10:1作为流动相洗脱,经HPLC分析检测,合并含有淡紫醌霉素甲酯(此时,石油醚:乙酸乙酯2:1)的馏分并浓缩,然后再用反相硅胶(YMC*GELODS-A,120A孔径,50um粒径)进行柱层析,用甲醇:水体积比60%~100%洗脱,将所得到的馏分经HPLC检测后合并含相同样品的馏分,得到化合物2,淡紫醌霉素甲酯,其结构示意图如图1所示。化合物2(淡紫醌霉素甲酯):橙红色晶体,由高分辨质谱HR-ESI-MS(m/z413.1252,[M+H]+)得到其分子式为C₂₃H₁₇N₄O₄。¹Hxa0NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ_H12.06(s,H,5′,8′-NH),8.83(d,J=8.5Hz,1H,H-3),8.51(d,J=8.0Hz,1H,H-12′),8.43(d,J=8.0Hz,1H,H-4),7.79(d,J=8.5Hz,1H,H-9′),7.72(t,J=7.5Hz,1H,H-10′),7.43(t,J=7.5Hz,1H,H-11′),5.95(s,1H,H-6),3.97(s,3H,1′-OCH₃),3.16(s,3H,3′-CH₃)。参考文献:Tetrahedronxa0Lett.1981,22,45954598。综上所述,本发明建立了利用链黑菌素产生菌通过基因工程手段制备淡紫醌霉素的方法,提高了淡紫醌霉素和淡紫醌霉素甲酯的产量,分别达到每5升培养基可以获得约1mg淡紫醌霉素和20mg淡紫醌霉素甲酯,并且经过菌种优化和发酵优化还有进一步提升的空间。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。